副主任醫(yī)師在線(xiàn)

擅長(zhǎng)：不孕不育的診治。

咨詢(xún)

輔助生殖中胚胎植入前遺傳學(xué)篩選有哪些爭(zhēng)議?胚胎植入前基因??診斷技術(shù)?

在英國(guó)，每7對(duì)夫婦中就有!對(duì)難以獲得妊娠。其中許多人需行體外受精的治療，即國(guó)家衛(wèi)生和醫(yī)療優(yōu)化研究所(National Institute for Health and Care ExcellenceNICE)推薦的對(duì)長(zhǎng)期不能獲得妊娠的不孕癥的有效治療方法。2014年英國(guó)共288女進(jìn)行6777IVF周期。20年的IVF治療周期較2013年增加了4.8%。

盡管隨著IVF2013英國(guó)每個(gè)治療周期的活產(chǎn)率為26.5%)。女行I成率更，其因是胎質(zhì)量差，且胚胎非整倍體率隨女性年齡的增長(zhǎng)而增加。一些研究顯示30歲及以下女性的胚胎非整倍體率約為 30%。而42 歲以上女性則高達(dá)85%。非整倍體胚胎也是高齡女性流產(chǎn)率較高的一個(gè)主要原因。

通過(guò)從胚胎中取出少量細(xì)胞(活檢)并進(jìn)行基因??分析，即植人前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening，PGS)，能夠在IVF治療過(guò)程中將染色體數(shù)目正常的整倍體胚胎移植到子宮內(nèi)，從而改善胚胎種植、減少流產(chǎn)并增加活產(chǎn)。

自首次應(yīng)用以來(lái)的25年間，在IVF周期中應(yīng)用PGS技術(shù)呈上升趨勢(shì)。本章中，我們將探討 PGS 技術(shù)的傳統(tǒng)和新興適應(yīng)證、植人前遺傳學(xué)診斷(PGD)的細(xì)胞取樣方法及其診斷準(zhǔn)確性。

有可能暴露胚胎的全部遺傳信息，在以此解決某些倫理難題的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生其他新的爭(zhēng)議。

二、植入前遺傳學(xué)檢測(cè)

雖然人們一直認(rèn)為植人前遺傳學(xué)檢測(cè)十分新穎，但早在1968年Gardner和Edwards就作了首次設(shè)想。他們對(duì)一枚家兔囊胚進(jìn)行了活檢和X染色質(zhì)分析，并認(rèn)為這種檢測(cè)方法也適用于人類(lèi)X連鎖隱性特征的分析。然而，直到1978年首次體外受精成功，人類(lèi)胚胎植入前遺傳學(xué)診斷才得到進(jìn)一步發(fā)展。1990年Handyside對(duì)第3天胚胎(卵裂期)進(jìn)行了首次卵裂球活檢，用于有鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶(OTC)缺乏(一種X連鎖疾病)風(fēng)險(xiǎn)胚胎的生孩子。1992年，該技術(shù)被進(jìn)一步應(yīng)用干囊性纖維化的檢測(cè)。目前，常用比較基因??組雜交(CGH)陣列技術(shù)檢測(cè)染色體異常。

三、植入前遺傳學(xué)檢測(cè)的類(lèi)型

隨著 PGS領(lǐng)域的不斷發(fā)展。各種POS技術(shù)的命名也發(fā)生了變化。植人前遺傳學(xué)檢澳分為三類(lèi)。

(1)單基因??疾病的植入前通傳學(xué)檢測(cè)(PGT-M)：PGT-M旨在鑒定妊娠是否受特定的遺傳特征影響，如生物學(xué)父母一方或雙方攜帶的、已加的遺傳基因??突變;還可以用于鑒定作為移植供體的胚胎，如具有特定生孩子或相容性人類(lèi)白細(xì)胞抗原復(fù)合體的胚胎

(2)染色體結(jié)構(gòu)重排的植人前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT-SR)：PGT-SR的目的是鑒定胚胎是否存在染色體結(jié)構(gòu)異常，如易位、缺失或重復(fù)

(3)非整倍體的植人前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT-A)：PGT-A曾稱(chēng)為植人前遺傳學(xué)篩查(PGS，旨在鑒定非整倍體胚胎)，前提是正確識(shí)別這些胚胎并進(jìn)行移植，從而降低流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。避免妊娠失敗相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生，并縮短從移植到獲得活胎妊娠的時(shí)間?。

四、植人前遺傳學(xué)篩查的指征

PGS 的最常見(jiàn)指征是檢測(cè)染色體異常，其中以非整倍體最常見(jiàn)。

??1、臨床上，PGS 的主要適應(yīng)證如下。

(1)單基因??疾病，如常染色體隱性遺傳病、常染色體顯性遺傳病或X連鎖疾病。(2)染色體結(jié)構(gòu)異常(如平衡易位)。

??2、在以下情況下，PGS 是提高持續(xù)妊婚率的常用方法。

(1)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。

(2)IVF助孕失敗(超過(guò)兩個(gè)周期)。

(3)女方高齡。

(4)既往育有染色體異常子女，或有染色體異常妊娠史。

(5) 染色體易位。

(6)染色體結(jié)構(gòu)異常疾病家族史。

(7)X連鎖疾病家族史。

(8)家族遺傳性疾病。

五、PGS用于染色體非整倍性的檢測(cè)

用于細(xì)胞遺傳學(xué)分析的PGD 首次是通過(guò)熒光原位雜交實(shí)現(xiàn)的。這項(xiàng)技術(shù)每周期能夠評(píng)估的染色體數(shù)量十分有限，通常為 5~9 個(gè)。鑒于這一局限性，通常需要進(jìn)行多個(gè)熒光原位雜交周期才能評(píng)估較多數(shù)量的染色體。此技術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)且需要依賴(lài)操作人員的經(jīng)驗(yàn)。

陣列 CGH 是一種基于CGH 的、能夠?qū)φ麄€(gè)基因??組進(jìn)行全面分析的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。陣列技術(shù)也可以應(yīng)用于產(chǎn)前絨毛活檢。

六、染色體重排

染色體重排包括易位或倒位，可能產(chǎn)生遺傳物質(zhì)不平衡的配子，進(jìn)而形成遺傳物質(zhì)不平衡的精卵。易位是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的常見(jiàn)病因之一。通常使用陣列CGH檢測(cè)染色體易位。這些病例有必要借助PGS技術(shù)降低維發(fā)于染色體異常的自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。

2004 年Goddijn 等的研究顯示，有染色體易位的夫婦獲得自然娃娠所需的平均時(shí)間?為4-6年。

2006 年Oani評(píng)PGD在這類(lèi)臨床情況中的使用情況，認(rèn)為通過(guò)PGS非該人群的自然流產(chǎn)率可以降低到5%。使用PGD終生累積妊為7.6%平均僅需1.24個(gè)周期即可獲得妊娠。

七、單基因??疾病

目前，大約有1/4 患者為檢測(cè)單個(gè)突變基因??接受植人前遺傳學(xué)診斷(PGD)。被檢測(cè)的基一般包括血紅蛋白病、囊性纖維化、脆性X綜合征和 Duchenne 肌營(yíng)養(yǎng)不良。

八、DNA 樣本的獲取

經(jīng)過(guò)1年驗(yàn)已經(jīng)囊胚期100~10個(gè)細(xì)胞組成的胚從而允許從滋養(yǎng)外胚層(囊胚的外層細(xì)胞)取出少量(~10個(gè))細(xì)胞進(jìn)行活檢。而過(guò)去的卵裂球活檢技術(shù)，則是從第3天卵裂期(4~8個(gè)細(xì)胞)的胚胎中取出僅1個(gè)或2個(gè)細(xì)胞進(jìn)行活檢。

除了能夠提供更多的細(xì)胞和遺傳物質(zhì)進(jìn)行分析外，滋養(yǎng)外胚層活檢已被證明比卵裂球活檢更全。此外，與早期僅能分析有限數(shù)量的染色體的熒光原位雜交技術(shù)相比，全面基因??檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展允許同時(shí)分析全部染色體(23對(duì))，這使PGS比以前更加可靠?；谶@些進(jìn)展，人們對(duì)使用滋養(yǎng)外胚層活檢和全面染色體篩查(CCS)的新一代PGS技術(shù)在IVF中的應(yīng)用再次產(chǎn)生了興趣。

基于胚胎發(fā)育天數(shù)和活檢指征，可以通過(guò)以下三種方法獲取DNA 樣本進(jìn)行分析。

(1) 極體活檢。

(2) 第 3 天胚胎的卵裂球活檢。

(3)第5~6天胚胎的滋養(yǎng)外胚層活檢。

(一)極體活檢

極體通常被認(rèn)為是卵子母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的副產(chǎn)物。因此，可以通過(guò)分析第一極體和第二極體推斷卵子母細(xì)胞的遺傳信息。在人類(lèi)卵子母細(xì)胞中，極體通常在形成后17~24h凋亡，所產(chǎn)生的碎片仍遺留在透明帶以?xún)?nèi)。

作為PGS 的一部分，極體活檢在某些禁止??進(jìn)行胚胎活檢的國(guó)家中非常實(shí)用。在這種情況下?；诼炎幽讣?xì)胞遺傳信息的可預(yù)測(cè)性，對(duì)極體的遺傳分析也可以作為評(píng)估胚胎遺傳信息的一種方法。

就本質(zhì)而言，極體是完全由自己體內(nèi)遺傳，因此極體活檢(polar body biopsyPBB)僅限于評(píng)估卵子母細(xì)胞發(fā)育過(guò)圖中由自己體內(nèi)通傳的突變或減數(shù)分裂錯(cuò)誤。因此，極體檢測(cè)無(wú)法評(píng)估父親的叢因型，加果父親密有常染色體是性遺傳疾病，則無(wú)法使用 Pm進(jìn)行診。第一板體和第二極體的話(huà)檢提供的信息僅能反映卵子母細(xì)胞的遺傳信息組成。

如果自己體內(nèi)是攜帶某個(gè)已知的突變基因??的雜合體，則二倍體初級(jí)卵子母細(xì)胞在減數(shù)第一次分裂時(shí)可能產(chǎn)生一個(gè)正常的次圾卵子母細(xì)胞和一個(gè)攜帶與自己體內(nèi)相同突變的第一極體。因此，如果 PBB 檢測(cè)絡(luò)果為該基因??正常無(wú)突變，則可以推測(cè)卵細(xì)胞攜管該突變基因??。相反，如果 PBB 檢測(cè)到該突壹基因??劇可以推測(cè)卵細(xì)胞不攜帶該突變基因??，這時(shí)卵子母細(xì)胞就可用于IVF。

極體為純母方來(lái)源，PBB 因面存在以下局限性;如果母親患有某種常染色體隱性遺傳疾病(地合子)，面父親也是攜替者。則 PBB 價(jià)值是有限的，因?yàn)樗新炎幽笓澃蜆O體都會(huì)擁帶這種突變。因此，有必要進(jìn)行囊胚活檢，從而同時(shí)檢測(cè)胚胎的母方和父方基因??

另一個(gè)局限性在于減數(shù)分裂過(guò)程中同源染色體間發(fā)生基因??重組。當(dāng)要檢測(cè)的基因??靠近染色體的前校(遠(yuǎn)端)區(qū)域時(shí)，PBB的檢測(cè)能力會(huì)進(jìn)一步受到限制，因?yàn)檫@些區(qū)域發(fā)生交叉互換的可能性里大。為了克服這一局限性，可能需要改進(jìn) PGT-M 的規(guī)程，將連鎖標(biāo)記、短申聯(lián)重復(fù)序列(STR或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)納人其中。但是，由于胚胎染色體三體通常來(lái)源于自己體內(nèi)減數(shù)分裂錯(cuò)誤，因此P0B 檢測(cè)可以滿(mǎn)足90%~95%的 PGD病例的需要。

還有一個(gè)局限性是在得到 PBB 檢測(cè)報(bào)告之前必須先對(duì)那母細(xì)胞進(jìn)行體外受精或冷庫(kù)保存。這種情況下，超過(guò)30%的卵子母細(xì)胞不能成功受精(即形成兩個(gè)原核)，或受精后不能繼續(xù)發(fā)育。PBB還存在遺傳局限性，即它檢出的一些減數(shù)第一次分裂的異常有可能在后線(xiàn)的減數(shù)第二次分裂中自我校正。

此外，PBB對(duì)配子融合后發(fā)生的遺傳異常的預(yù)測(cè)能力有限。這些有經(jīng)分裂異常通常發(fā)生在雌雄原核融合之后。

(二)卵裂期懷胎(8細(xì)抱期卵制球活檢)

在第3天對(duì)卵裂期胚胎進(jìn)行活檢，此時(shí)的胚胎大約由8個(gè)細(xì)胞組成，被包繞在適明帶以?xún)?nèi)。在此階段，可以穿過(guò)適明帶取出細(xì)胞進(jìn)行PGT檢測(cè)。第3天活檢需要一次從即裂喙中取出一個(gè)組胞。

Cohen 等和DeVos等研究了單細(xì)胞和兩組胞活檢對(duì)胚胎存活率的影響，結(jié)果顯示活檢一個(gè)期出和兩個(gè)細(xì)胞后的活產(chǎn)率分別為37.4%和 22.4%。

因?yàn)槁蚜哑诨顧z只能檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞，所以其局限性和診斷難題是胚胎嵌合可以發(fā)生在各種組織中，但胚胎形成早期階段的遺傳嵌合被認(rèn)為是胚胎遺傳自我校正的結(jié)果。

九、滋養(yǎng)外胚層活檢

囊胚于受精后5-6天形成，通常包括100多個(gè)細(xì)胞。

在此階段，可以取出更多的細(xì)胞用于診斷。滋養(yǎng)外胚層是一組位于囊胚外層的細(xì)胞，由于滋養(yǎng)外胚層后續(xù)發(fā)育成胎盤(pán)，因此從技術(shù)角度而言，胎兒組織并沒(méi)有被活檢。西區(qū)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的方法是使用微型移液器吸取細(xì)胞藿香胚胎開(kāi)口處輕壓囊胚。為了減輕對(duì)胎盤(pán)發(fā)育的影響，一次滋養(yǎng)外胚層活檢通常吸取5-8個(gè)細(xì)胞。在各種PGS技術(shù)中，囊胚活檢技術(shù)對(duì)胚胎后續(xù)發(fā)育的影響最小，而為檢測(cè)提供的DNA量最多，從而降低了診斷錯(cuò)誤的概率。

十、保存

由于出具活檢結(jié)果報(bào)告所需要的時(shí)間?比較長(zhǎng)，通常先將胚胎或者卵子母細(xì)胞玻璃化保存，知道獲得遺傳分析結(jié)果。值得注意的是，如果有必要，可以進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)或驗(yàn)證性分析?？梢詫?duì)在囊胚期接受過(guò)活檢保存胚胎解凍、再次活檢和再次玻璃化保存。然而，被解凍并做第二次活檢的胚胎的存活率可能比較低了。

十一、植入前遺傳學(xué)篩查的局限性

迄今，在受精后第3天行胚胎移植仍然是IVF的常規(guī)操作。在體外培養(yǎng)條件下，大約50%的胚胎能夠存活并發(fā)育到第3天，但是只有大約25%的胚胎能夠存活到第五天或第六天并發(fā)育為囊胚。相對(duì)第5-6天活檢而言，第三天活檢的局限性明顯，如果為行PGS需要延長(zhǎng)體外培養(yǎng)值囊胚期，那么沒(méi)有可用于活檢貨一直胚胎的患者的比例可能增加。這將進(jìn)一步導(dǎo)致可用于檢測(cè)、移植或保存的胚胎數(shù)量減少。

此外，觀察性研究指出延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間?值囊胚期可能會(huì)增加單卵多胎和男性新生兒的概率，同時(shí)與遺傳修飾相關(guān)的新生兒不良結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)可能升高。

然而越來(lái)越多的IVF方案采用第5天胚胎移植，及時(shí)不進(jìn)行PGT者也是如此。在這種情況下，延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間?至囊胚期的原因是，移植第五天胚胎的活產(chǎn)率比移植第三天胚胎更高。在美國(guó)，大約60%的IVF方案是在受精后第五天將胚胎移植到子宮，只有30%在第三天移植。

十二、染色體嵌合

胚胎嵌合體是PGS的主要局限性之一，常被認(rèn)為是假陽(yáng)性誤差的最主要來(lái)源。染色體嵌合是指同一胚胎中的不同細(xì)胞具有不同數(shù)目染色體，這在IVF來(lái)源的人類(lèi)胚胎中非常常見(jiàn)。

由于胚胎嵌合體的特性及出現(xiàn)非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)，胚胎嵌合體可能會(huì)降低單個(gè)助孕周期的總?cè)焉锫省?/p>

多達(dá)50%的胚胎都可能出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象，后者通常繼發(fā)于受精后有絲分裂錯(cuò)誤，從而形成兼有整倍體細(xì)胞和非整倍體細(xì)胞的獨(dú)特細(xì)胞群。胚胎內(nèi)染色體數(shù)目異常細(xì)胞的比例與有絲分裂錯(cuò)誤發(fā)生時(shí)胚胎所處的發(fā)育階段有關(guān)。

發(fā)生錯(cuò)誤時(shí)胚胎所處的階段越早，異常細(xì)胞的比例越高。因?yàn)榉钦扼w細(xì)胞系的分裂速度比整倍體細(xì)胞慢，所以可能會(huì)發(fā)生“自我校正”，胚胎中費(fèi)整倍體細(xì)胞的百分比可能隨時(shí)間?而逐漸降低。值得注意的是，上游1%-2%的妊娠期絨毛活檢發(fā)現(xiàn)了嵌合體。因此，通過(guò)前文所述途徑獲取DNA后發(fā)現(xiàn)嵌合體可能并不能代表胚胎動(dòng)態(tài)發(fā)育過(guò)程中其余細(xì)胞的實(shí)際染色體構(gòu)成。

移植這種嵌合體胚胎能否獲得正?；町a(chǎn)而目前尚不清楚。最近的一項(xiàng)研究對(duì)3802個(gè)胚胎在囊胚期進(jìn)行活檢，在其中181枚胚胎中檢測(cè)到了染色體嵌合現(xiàn)象。這項(xiàng)研究中有18名女性沒(méi)有整倍體囊胚，并同意移植一個(gè)非整倍體嵌合胚胎，最終獲得8例臨床妊娠和6例單胎足月活產(chǎn)。