美國(guó)試管嬰兒胚胎植入前基因檢測(cè)（PGT）操作全流程：從實(shí)驗(yàn)室到臨床決策

在美國(guó)輔助生殖領(lǐng)域，胚胎植入前基因檢測(cè)（Preimplantation Genetic Testing, PGT）已形成標(biāo)準(zhǔn)化操作體系，其流程精密銜接IVF周期的每個(gè)環(huán)節(jié)，既需尖端技術(shù)支撐，也依賴嚴(yán)格的質(zhì)量控制。以下從技術(shù)實(shí)施角度解析其核心操作邏輯。

一、檢測(cè)前的臨床評(píng)估與方案制定

PGT啟動(dòng)前需完成三重評(píng)估：

適應(yīng)癥確認(rèn)：根據(jù)美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)（ASRM）指南，僅適用于：

女方年齡≥38歲（非整倍體風(fēng)險(xiǎn)＞20%）；

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（≥3次）或反復(fù)種植失?。ā?次優(yōu)質(zhì)胚胎移植未孕）；

已知染色體異常（如平衡易位、羅氏易位）或單基因病家族史（如Huntington舞蹈癥）；

遺傳信息建檔：采集父母外周血進(jìn)行全基因組測(cè)序或核型分析，建立致病位點(diǎn)/染色體斷點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，囊性纖維化患者需明確CFTR基因的突變類型（如ΔF508）；

檢測(cè)技術(shù)選型：根據(jù)臨床需求選擇PGT-A（非整倍體篩查）、PGT-M（單基因?。┗騊GT-SR（結(jié)構(gòu)重排），美國(guó)約60%周期采用NGS平臺(tái)的PGT-A。

二、胚胎培養(yǎng)與活檢的實(shí)驗(yàn)室操作

1.胚胎發(fā)育監(jiān)控與活檢時(shí)機(jī)

囊胚期優(yōu)先策略：90%的美國(guó)IVF中心選擇第5-6天囊胚期活檢，此時(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞（TE）分化為100-150個(gè)細(xì)胞，提取5-10個(gè)細(xì)胞不影響胚胎發(fā)育。研究顯示，囊胚活檢比卵裂期（第3天）活檢的臨床妊娠率高12%-18%；

時(shí)差成像（Time-Lapse）輔助：通過連續(xù)拍攝胚胎發(fā)育動(dòng)態(tài)，篩選出卵裂同步、無(wú)碎片的優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行活檢，減少因形態(tài)學(xué)評(píng)估誤差導(dǎo)致的誤判。

2.活檢技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化流程

以激光輔助活檢為例：

 

固定與定位：用持卵管固定胚胎，在TE細(xì)胞聚集區(qū)域（遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)ICM）標(biāo)記活檢位點(diǎn)；

透明帶打孔：使用1480nm激光脈沖（能量5-10mJ）在透明帶制造直徑10-15μm的孔洞；

細(xì)胞提?。河?0μm活檢針通過孔洞輕柔吸出5-10個(gè)TE細(xì)胞，立即放入含蛋白酶K的裂解液中，-80℃保存待測(cè)序；

質(zhì)量控制：每例樣本需進(jìn)行污染檢測(cè)——提取實(shí)驗(yàn)室空氣、培養(yǎng)液等環(huán)境DNA作為陰性對(duì)照，避免母體細(xì)胞或外源DNA污染（美國(guó)實(shí)驗(yàn)室污染率控制在0.3%以下）。

三、基因檢測(cè)的分子生物學(xué)流程

1.DNA提取與擴(kuò)增

單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增（WGA）：對(duì)5-10個(gè)TE細(xì)胞采用MDA（多重置換擴(kuò)增）技術(shù)，通過φ29 DNA聚合酶進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，獲得微克級(jí)DNA（原始模板僅1-5ng）；

質(zhì)控關(guān)鍵點(diǎn)：擴(kuò)增產(chǎn)物需通過Qubit熒光定量（濃度＞10ng/μL）和Agilent 2100檢測(cè)（片段分布100-1000bp），排除擴(kuò)增失?。s5%概率）或降解樣本。

2.NGS測(cè)序與生物信息學(xué)分析

以PGT-A為例：

文庫(kù)構(gòu)建：對(duì)WGA產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾和接頭連接，通過PCR擴(kuò)增生成測(cè)序文庫(kù)（插入片段200-300bp）；

高通量測(cè)序：使用Illumina NovaSeq等平臺(tái)進(jìn)行1-2X覆蓋度的全基因組測(cè)序，單個(gè)胚胎數(shù)據(jù)量約50-100Mb；

染色體分析：通過Sentieon、BlueFuse等軟件比對(duì)人類參考基因組（GRCh38），計(jì)算每條染色體的測(cè)序深度比值，當(dāng)比值＞1.1或＜0.9時(shí)判定為非整倍體；

嵌合率評(píng)估：若某染色體區(qū)域的異常細(xì)胞比例在20%-50%之間，判定為嵌合體（美國(guó)臨床通常僅移植整倍體或低嵌合率胚胎）。

3.PGT-M/SR的特殊步驟

連鎖分析：針對(duì)單基因病（如血友?。柙谥虏』蛏舷掠卧O(shè)計(jì)50-100個(gè)SNP標(biāo)記，通過單體型分析判斷胚胎是否攜帶致病等位基因；

斷點(diǎn)定位：對(duì)染色體易位患者，先通過父母全基因組測(cè)序確定斷裂點(diǎn)（如t (11;22)(q23;q11)），再在胚胎中檢測(cè)斷裂點(diǎn)附近5Mb區(qū)域的序列完整性。

四、檢測(cè)報(bào)告解讀與臨床決策

美國(guó)PGT報(bào)告包含三層信息：

核型判定：明確胚胎為整倍體、非整倍體或嵌合體，附各染色體拷貝數(shù)熱圖；

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：如PGT-M報(bào)告需標(biāo)注“致病純合子”“雜合子”“野生型”及遺傳風(fēng)險(xiǎn)概率；

移植建議：根據(jù)ASRM指南，整倍體胚胎優(yōu)先移植，嵌合率＜30%的胚胎可謹(jǐn)慎考慮，非整倍體胚胎建議丟棄。

整個(gè)流程從活檢到報(bào)告通常需5-7天，美國(guó)頂尖實(shí)驗(yàn)室（如RMA、CCRM）的檢測(cè)周期可壓縮至3天，配合玻璃化冷凍技術(shù)實(shí)現(xiàn)“全胚冷凍+解凍移植”策略，將臨床妊娠率提升至65%-70%。而嚴(yán)格的ISO 15189認(rèn)證體系（美國(guó)85%的PGT實(shí)驗(yàn)室通過該認(rèn)證），則確保了從樣本接收到結(jié)果報(bào)告的全流程可追溯性。

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