小分子生產(chǎn)越來越困難，而大分子則發(fā)展非常強(qiáng)勁，似乎已經(jīng)成為近年來藥物研發(fā)市場的重要表現(xiàn)之一。 “”藥物是的藥物之一。 目前，藥物的質(zhì)量監(jiān)管日趨嚴(yán)格。 在此趨勢下，尋找能夠滿足更高分辨率和靈敏度的分析方法顯得尤為重要。 很多朋友在開發(fā)樣品的分析方法時，總會遇到各種問題，苦惱不已。 這里醫(yī)生總結(jié)了肽方法開發(fā)中的一些常見問題與大家分享。

1. 肽含量和肽有什么區(qū)別？

產(chǎn)品除了肽本身外，還含有生產(chǎn)過程中帶入的水、有機(jī)鹽等雜質(zhì)。 的僅指產(chǎn)物的含量和本身所含雜質(zhì)的含量，不包括水等雜質(zhì)； 而含量是指產(chǎn)品中目標(biāo)肽的凈含量，一般采用N元素分析或氨基酸分子方法檢測； 因此，即使一種肽的達(dá)到99%，由于產(chǎn)品還含有水和有機(jī)鹽，其含量可能只有70-80%。

2. 如何溶解？

大多數(shù)肽可以溶解在超純水中。 對于一些不溶性肽，需要首先分析氨基酸序列。 對于酸性肽，可將其溶解在少量堿性（如0.1%氨水）溶液中，然后稀釋至所需濃度。 ，對于堿性肽，可將其溶解于少量酸性（如醋酸、三醋酸）溶液中，然后稀釋至所需濃度。 對于疏水性肽，可用有機(jī)溶劑溶解，如DMF、甲醇、丙醇、異丙醇、DMSO等。

3. 為什么流動相中要添加三作為離子對試劑？ 還有哪些其他流動相系統(tǒng)或離子對試劑可用于肽的分離和純化？

添加三可以調(diào)節(jié)洗脫液的pH值，并作為離子對試劑與相互作用，從而增強(qiáng)分離效果并顯著改善峰形。

其他可用于肽分離純化的流動相體系或離子對試劑還有乙酸體系、磷酸體系、鹽酸體系、七氟丁酸等。適??當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可達(dá)到良好的分離效果。

另外，三優(yōu)于其他離子改性劑的原因是它容易揮發(fā)，可以很容易地從制備的樣品中去除。 另一方面，三的較大紫外吸收峰低于200nm，這對于低波長的來說非常重要。 檢測干擾很小。

4、檢測時出現(xiàn)柱壓升高、柱效降低的問題如何解決？

對于日常色譜柱沖洗和維護(hù)，您可以遵循色譜柱工廠說明。 然而，在分析肽等蛋白質(zhì)樣品時，容易出現(xiàn)另一種現(xiàn)象：蛋白質(zhì)污染。 主要原因是塔頂填料結(jié)塊。 如果出現(xiàn)蛋白質(zhì)污染，建議使用乙腈-水-三=50-50-0.1小流量反洗60倍柱體積或反洗過夜。

5. 肽樣品在新的硅膠基質(zhì)色譜柱上不出峰或峰面積異常小。 為什么是這樣？

這是因?yàn)槿嗫浊蛐喂枘z柱上的非特異性吸附位點(diǎn)對肽產(chǎn)生死吸附，導(dǎo)致沒有峰。

色譜柱中的非特異性吸附位點(diǎn)主要來自殘留的硅烷醇基團(tuán)、硅膠中殘留的重金屬以及鍵合相脫落后暴露的硅烷醇基團(tuán)。 柱管內(nèi)壁無鈍化位點(diǎn)。 這些將對肽樣品具有強(qiáng)烈的非特異性吸附。

事實(shí)上，當(dāng)開始使用新的色譜柱時，生物樣品的非特異性吸附會更加嚴(yán)重，因此色譜柱可以飽和高濃度樣品。 正式檢測前的預(yù)采樣可以使樣品在色譜柱上積累并覆蓋這些位點(diǎn)，以便我們在以后的分析中獲得良好的色譜圖。 建議每分鐘進(jìn)樣一次，連續(xù)插入十幾根針，用多余的樣品覆蓋非特異性吸附位點(diǎn)。 一旦峰面積和峰形穩(wěn)定，即可正式測試樣品。

6. TFA僅起到調(diào)節(jié)緩沖液pH值的作用嗎？ TFA 濃度越高，基線漂移越大。 這是否意味著在緩沖液 pH 允許的情況下，TFA 濃度越低越好？

(1) TFA起到類似于離子對的作用。 一般濃度為0.05-0.1%。 濃度過高會使溶液呈酸性，長期使用可能會影響色譜柱的壽命。

(2)同時，TFA可以控制硅膠表面的硅烷醇基，改善堿性化合物的峰形。 有時 0.1% TFA 不能很好地分離。 考慮將濃度增加至 0.2%。 但使用后請務(wù)必立即沖洗色譜柱。

7. 肽段檢測時經(jīng)常出現(xiàn)基線漂移的原因是什么？ 怎么處理呢？

使用固定三濃度的梯度洗脫有時會導(dǎo)致 210-220 nm 檢測時吸收基線發(fā)生漂移，這是許多反相分離中基線漂移的原因。

為了減少或消除三光譜吸收變化引起的基線漂移，需要使檢測波長盡可能接近215nm，并且溶劑B中三的添加量比溶劑A少15%，以補(bǔ)償基線漂移。 例如，當(dāng)溶劑A中的三乙酸為0.1%時，溶劑B中可以使用0.085%。

8、純化過程中使用的色譜柱填料如何選擇？

不同序列的肽的理化性質(zhì)和疏水性存在很大差異。 大多數(shù)情況下，C18柱對于分子量小于4000的肽和親水性肽的分離效果。 C4柱對于分子量大于5000、j端疏水性的肽分離效果。 ，而C8柱介于C18和C4柱之間，其應(yīng)用效果與C18柱更為相似； 對于一些選擇性特別強(qiáng)的肽，還可以選擇柱。

9、另附生物樣品分析過程中常見問題及解決建議。

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?XB-C18 (300?),

?LP-C18 (300?),

?XB-C4 (300?),

?XB-C8 (300?),

? LP-C8 (300?)；

規(guī)格：4.6×250mm、5μm

（也可以選擇其他規(guī)格）

★適合蛋白質(zhì)、或其他大分子的方法開發(fā)。 為了更好地與鍵合相相互作用，需要大孔徑 (300?) 填料。

★ 不同的選擇性鍵合相具有不同的保留能力，滿足各種分子大小的蛋白質(zhì)和的保留和分離。

附應(yīng)用案例頻譜圖